Co NTA Beads 6FF可以从原核和真核表达系统中一步纯化His标签蛋白。该产品是以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,配体以四配位键螯合钴。Co NTA Beads 6FF相比Ni NTA Beads 6FF对His标签蛋白具有更高的选择性。具体性能见表1。
表1. Co NTA Beads 6FF的产品性能
性能
指标
基质
高度交联的6%琼脂糖凝胶
螯合离子
Co2+
载量(/mL基质)
>20mg 6╳His-tagged protein
微球粒径(μm)
45–165
最大压力
0.3 MPa, 3 bar
储存缓冲液
含20% 乙醇的1XPBS
储存温度
4°C-30°C
Co NTA Beads 6FF可以耐受一定范围的变性剂和其他的添加剂,如表2。
表2. Co NTA Beads 6FF试剂耐受情况
试剂种类
浓度
还原剂
10 mM β-mercaptoethanol1
变性剂
8 M urea
6 M Gua-HCl
去污剂
<1% Triton™ X-100
1% NP-40
1% CHAPS ,SDS, sarcosyl
其他类
≤500 mM imidazole at pH7.0 to 8.0 for elution
30% ethanol2
20% glycerol
500 mM KCl
1.0 M NaCl
20mM MES
50 mM Tris3
50 mM HEPES
50 mM MOPS
Note: 1 Co NTA Beads 6FF立即用平衡液平衡,否则介质会变色。不要将介质保存在含有β-Mercaptoethanol的缓冲液中。
2 过高浓度的咪唑有可能会降低蛋白回收率。
3乙醇有可能造成蛋白沉淀,降低蛋白回收率和堵柱子。
4 Tris与金属离子微弱结合造成载量降低。
避免使用下列试剂:DTT (dithiothreitol), DTE (dithioerythritol) and TCEP (TRIS (2-carboxyethyl) phosphine).会降低介质的蛋白载量。
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 、 EGTA (ethylene Glycolbis ([β-amino-ethyl ether])会将钴离子从介质上剥落。
问题
原因分析
推荐解决方案
柱子反压过高
填料被堵塞
裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45μm)过滤,或者离心去除。
样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直至粘度降低,或者添加DNase I (终浓度5 μg/ml),Mg2+ (终浓度 1 mM),冰上孵育10-15分钟。
样品太粘稠
有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白
蛋白可能是包涵体,没有在上清中
可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白,包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。
表达量太低
优化表达条件。
目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤被洗下来了
提高洗杂液的pH,或者降低咪唑浓度。
目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来
降低洗脱液的pH值,或者增加洗脱液中咪唑浓度。
使用10-100mM EDTA溶液剥离钴离子,同时得到目的蛋白。
蛋白降解
菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。在4°C下进行纯化操作。
洗脱组分不纯(含有多种蛋白)
洗杂不彻底
增加洗杂液体积。
样品中含有其他的组氨酸标签蛋白
通过调节pH值,或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段(如离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。
填料颜色变浅
Co离子被剥落
参考part3重新螯合钴离子。
上样过程中蛋白发生沉淀
操作温度太低
室温下进行上样。
蛋白发生聚集
在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂,如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。