GST标签亲和纯化试剂盒，GSTPur Glutathione Kit

Glutathione Beads

基质

4%琼脂糖微球

配体

通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽

载量（/ml 介质）

>20 mg GST蛋白(26 kDa)

粒径 (μm)

45-165

最大流速

0.1 MPa, 1 bar

pH 稳定范围

3-12

储存缓冲液

20% 乙醇

储存温度

2°C - 8°C

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高 

填料被堵塞

按照第3部分进行树脂清洗。

裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜 (0.22或0.45μm) 过滤，或者离心去除。

样品太粘稠

样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg²⁺（终浓度 1 mM），冰上孵育10-15分钟。

缓冲液太粘稠

有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。

洗脱组分中没有目的蛋白

GST标签蛋白变性了

使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。

过度的裂解使目的蛋白变性

目的蛋白聚集产生了沉淀

在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为

1–20 mM。

融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合力

测定pGEX 中GST的结合力，对载体进行超声处理，检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力，有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力。

降低结合温度至+4°C，充分地清洗。

柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在pH6.5-pH8范围内结合的

用 pH 6.5 –pH 8.0的Buffer进行充分的平衡 (例如PBS) 。

目的蛋白没有完全洗脱下来

洗脱体积太少

增加洗脱液体积，减小洗脱流速。

洗脱液中谷胱甘肽浓度太低

增加洗脱液中谷胱甘肽浓度，可尝试用50 mM Tris-HCl, 20–40 mM还原型谷胱甘肽, pH 8.0洗脱。

低pH影响洗脱

在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时，提高洗脱液中pH至pH 8–9 会有改善。 

增加洗脱液中离子强度，如0.1–0.2 M NaCl。 

洗脱液中的谷胱甘肽被氧化

使用新鲜配制的洗脱液

加入 DTT。

非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解与洗脱

洗脱液中加入非离子型洗涤剂，如0.1%的Triton X-100 或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20。 

电泳或western blot检测中发现多条带

Mr 70 000 蛋白与目的蛋白一起被纯化出来

Mr 70 000的蛋白有可能是大肠杆菌基因dnaK 的产物，可以通过在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl, 2 mM ATP, 10 mM MgSO₄, pH 7.4在37°C加热10 分钟去除。

可以通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的DnaK 蛋白。

GST融合蛋白已经发生降解

在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF。

有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如 lon-或ompT)。 

细胞破碎过度

减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶(菌液体积的0.1 倍的 10 mg/ml溶菌酶，25 mM Tris-HCl, pH 8.0)，避免发泡导致蛋白变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。

共价共纯化

包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化，如：DnaK (Mr ~ 70 000)， DnaJ (Mr ~ 37 000)， GrpE (Mr ~ 40 000)，GroEL (Mr ~ 57 000) 和 GroES (Mr ~10 000)。可再进行一次纯化可以改善。 

抗体与E. coli 的各种蛋白反应

抗体吸附E. coli蛋白：GST-抗体。 超声处理去除GST抗体，可以用Western Blots 检测。

名称

货号

规格

Glutathione Beads

SA008010

10mL

SA008025

25mL

SA008100

100mL

SA008C

1L

GSTPur Glutathione Kit

SA008K

3次

SA008K05

5次

Glutathione Beads 4FF

SA010010

10mL

SA010050

50mL

SA010100

100mL

SA010500

500mL

SA010C

1L

GSTCap 4FF

SA010C11

1X1mL

SA010C51

5x1mL

SA010C15

1X5mL

SA010C55

5X5mL

SA010CS

3X1mL+1X5mL