GST标签亲和纯化填料4FF预装柱 [谷胱甘肽琼脂糖凝胶]，GSTCap 4FF

项目

Glutathione Beads 4FF

基质

高度交联的4%琼脂糖凝胶

配体

通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽

载量（/ml 介质）

>10 mg GST蛋白(40 kDa)

粒径 (μm)

45-165

最大流速

0.3 MPa, 3 bar

pH 稳定范围

3-12

储存缓冲液

20% 乙醇

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高 

填料被堵塞

按照第3部分进行填料清洗。

裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜 (0.22或0.45μm) 过滤，或者离心去除。

样品太粘稠

样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg²⁺（终浓度 1 mM），冰上孵育10-15分钟。

缓冲液太粘稠

有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。

洗脱组分中没有目的蛋白

GST标签蛋白变性了

使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。

过度的裂解使目的蛋白变性

目的蛋白聚集产生了沉淀

在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为

1–20 mM。

融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合力

测定pGEX 中GST的结合力，对载体进行超声处理，检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力，有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力。

降低结合温度至+4°C，充分地清洗。

柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在pH6.5-pH8范围内结合的

用 pH 6.5 –pH 8.0的Buffer进行充分的平衡 (例如PBS) 。

目的蛋白没有完全洗脱下来

洗脱体积太少

增加洗脱液体积，减小洗脱流速。

洗脱液中谷胱甘肽浓度太低

增加洗脱液中谷胱甘肽浓度，可尝试用50 mM Tris-HCl, 20–40 mM还原型谷胱甘肽, pH 8.0洗脱。

低pH影响洗脱

在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时，提高洗脱液中pH至pH 8–9 会有改善。 

增加洗脱液中离子强度，如0.1–0.2 M NaCl。 

洗脱液中的谷胱甘肽被氧化

使用新鲜配制的洗脱液

加入 DTT。

非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解与洗脱

洗脱液中加入非离子型洗涤剂，如0.1%的Triton X-100 或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20。 

电泳或western blot检测中发现多条带

Mr 70 000 蛋白与目的蛋白一起被纯化出来

Mr 70 000的蛋白有可能是大肠杆菌基因dnaK 的产物，可以通过在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl, 2 mM ATP, 10 mM MgSO₄, pH 7.4在37°C加热10 分钟去除。

可以通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的DnaK 蛋白。

GST融合蛋白已经发生降解

在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF。

有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如 lon-或ompT)。 

细胞破碎过度

减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶(菌液体积的0.1 倍的 10 mg/ml溶菌酶，25 mM Tris-HCl, pH 8.0)，避免发泡导致蛋白变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。

共价共纯化

包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化，如：DnaK (Mr ~ 70 000)， DnaJ (Mr ~ 37 000)， GrpE (Mr ~ 40 000)，GroEL (Mr ~ 57 000) 和 GroES (Mr ~10 000)。可再进行一次纯化可以改善。 

抗体与E. coli 的各种蛋白反应

抗体吸附E. coli蛋白：GST-抗体。 超声处理去除GST抗体，可以用Western Blots 检测。