1.产品介绍
Glutathione Beads 4FF可以纯化各种表达系统融合表达的谷胱甘肽-S-转移酶的目的蛋白、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽转移酶的重组衍生物。Glutathione Beads 4FF是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,因其耐压的基质,该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化,可以在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化。Glutathione Beads 4FF可以耐受最高0.3 MPa的压力,更稳定。具体性能见表1。
GSTCap 4FF是一种中低压预装柱,有1 ml和5 ml两种规格,分别填装1 ml和5 ml Glutathione Beads 4FF,共有5种不同包装规格的产品。预装柱具有标准接口,可以适配商品化的各类中压色谱系统,如ÄKTA等,方便客户操作。
表1. Glutathione Beads 4FF产品性能
项目
Glutathione Beads 4FF
基质
高度交联的4%琼脂糖凝胶
配体
通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽
载量(/ml 介质)
>10 mg GST蛋白(40 kDa)
粒径 (μm)
45-165
最大流速
0.3 MPa, 3 bar
pH 稳定范围
3-12
储存缓冲液
20% 乙醇
2. 问题及解决方案
问题
原因分析
推荐解决方案
柱子反压过高
填料被堵塞
按照第3部分进行填料清洗。
裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜 (0.22或0.45μm) 过滤,或者离心去除。
样品太粘稠
样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直至粘度降低,或者添加DNase I (终浓度5 μg/ml),Mg2+(终浓度 1 mM),冰上孵育10-15分钟。
缓冲液太粘稠
有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白
GST标签蛋白变性了
使用温和的裂解条件,实验条件以经验为准。
过度的裂解使目的蛋白变性
目的蛋白聚集产生了沉淀
在细胞裂解前溶液中加入DTT,终浓度为
1–20 mM。
融合蛋白改变了GST的构象,影响了目的蛋白的结合力
测定pGEX 中GST的结合力,对载体进行超声处理,检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力,有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力。
降低结合温度至+4°C,充分地清洗。
柱子平衡时间太短,目的蛋白不是在pH6.5-pH8范围内结合的
用 pH 6.5 –pH 8.0的Buffer进行充分的平衡 (例如PBS) 。
目的蛋白没有完全洗脱下来
洗脱体积太少
增加洗脱液体积,减小洗脱流速。
洗脱液中谷胱甘肽浓度太低
增加洗脱液中谷胱甘肽浓度,可尝试用50 mM Tris-HCl, 20–40 mM还原型谷胱甘肽, pH 8.0洗脱。
低pH影响洗脱
在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时,提高洗脱液中pH至pH 8–9 会有改善。
增加洗脱液中离子强度,如0.1–0.2 M NaCl。
洗脱液中的谷胱甘肽被氧化
使用新鲜配制的洗脱液
加入 DTT。
非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解与洗脱
洗脱液中加入非离子型洗涤剂,如0.1%的Triton X-100 或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20。
电泳或western blot检测中发现多条带
Mr 70 000 蛋白与目的蛋白一起被纯化出来
Mr 70 000的蛋白有可能是大肠杆菌基因dnaK 的产物,可以通过在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl, 2 mM ATP, 10 mM MgSO4, pH 7.4在37°C加热10 分钟去除。
可以通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的DnaK 蛋白。
GST融合蛋白已经发生降解
在裂解液中加入蛋白酶抑制剂,如加入1 mM PMSF。
有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的,可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如 lon-或ompT)。
细胞破碎过度
减少细胞破碎时间,超声前加入溶菌酶(菌液体积的0.1 倍的 10 mg/ml溶菌酶,25 mM Tris-HCl, pH 8.0),避免发泡导致蛋白变性,过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。
共价共纯化
包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化,如:DnaK (Mr ~ 70 000), DnaJ (Mr ~ 37 000), GrpE (Mr ~ 40 000),GroEL (Mr ~ 57 000) 和 GroES (Mr ~10 000)。可再进行一次纯化可以改善。
抗体与E. coli 的各种蛋白反应
抗体吸附E. coli蛋白:GST-抗体。 超声处理去除GST抗体,可以用Western Blots 检测。