镍金属螯合Smart亲和纯化填料 [His标签蛋白]，Ni Smart Beads

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22或0.45μm）过滤，或者离心去除。

洗脱组分中没有目的蛋白

样品中无His标签蛋白

采用Western Blotting等确定样品中是否含有目的蛋白。

表达量太低

优化表达条件。

目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤被洗下来了

提高洗杂液的pH，或者降低咪唑浓度

目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来

降低洗脱液的pH值，或者增加洗脱液中咪唑浓度。

蛋白降解

菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。

洗脱组分不纯（含有多种蛋白）

洗杂不彻底

增加洗杂液体积。

样品中含有其他的组氨酸标签蛋白

通过调节pH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。

上样过程中蛋白发生沉淀

操作温度太低

室温下进行上样。

蛋白发生聚集

在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。