钴金属螯合NTA亲和纯化填料 [His标签蛋白]，Co NTA Beads

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22或0.45μm）过滤，或者离心去除。

样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg²⁺ （终浓度 1 mM），冰上孵育10-15分钟。

样品太粘稠

有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。

洗脱组分中没有目的蛋白

蛋白可能是包涵体，没有在上清中

可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。

表达量太低

优化表达条件。

目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤被洗下来了

提高洗杂液的pH，或者降低咪唑浓度。

目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来

降低洗脱液的pH值，或者增加洗脱液中咪唑浓度。

使用10-100mM EDTA溶液剥离钴离子，同时得到目的蛋白。 

蛋白降解

菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。在4°C下进行纯化操作。

洗脱组分不纯（含有多种蛋白）

洗杂不彻底

增加洗杂液体积。

样品中含有其他的组氨酸标签蛋白

通过调节pH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。

填料颜色变浅

Co离子被剥落

参考part3重新螯合钴离子。

上样过程中蛋白发生沉淀

操作温度太低

室温下进行上样。

蛋白发生聚集

在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。