1. 产品介绍
Ni NTA Beads 6FF是以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,配体与Ni NTA Beads 相同(产品结构见图1所示),具体性能见表1。Ni NTA Beads 6FF除了可以耐受苛刻的试剂条件(见表2)外,因其耐压的基质,可以耐受最高0.3 MPa的压力,更稳定,因此该产品更适合用于工业大规模蛋白的纯化,可以在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化。
表1. Ni NTA Beads 6FF产品性能
Ni NTA Beads 6FF
基质
高度交联的6%琼脂糖凝胶
载量(/mL基质)
>40mg 6XHis-tagged
protein
微球粒径(μm)
45–165
最大压力
0.3 MPa, 3 bar
储存缓冲液
含20% 乙醇的1XPBS
储存温度
4°C-30°C
表2. Ni NTA Beads 6FF试剂耐受情况
试剂种类
浓度
还原剂
5 mM DTE
1 mM DTT
20 mM β-mercaptoethanol
5 mM TCEP
10 mM reduced glutathione
变性剂
8 M urea
6 M Gua-HCl
去污剂
2% Triton™ X-100 (nonionic)
2% Tween™ 20 (nonionic)
2% NP-40 (nonionic)
2% Cholate (anionic)
1% CHAPS (zwitterionic)
其他类
500 mM imidazole
20% ethanol
50% glycerol
100 mM Na2SO4
1.5 M NaCl
1 mM EDTA
60 mM citrate
缓冲液
50 mM sodium phosphate, pH 7.4
100 mM Tris-HCl, pH 7.4
100 mM Tris-acetate, pH 7.4
100 mM HEPES, pH 7.4
100 mM MOPS, pH 7.4
100 mM sodium acetate, pH 4
2. 问题及解决方案
问题
原因分析
推荐解决方案
柱子反压过高
填料被堵塞
裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45μm)过滤,或者离心去除。
样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直至粘度降低,或者添加DNase I (终浓度5 μg/ml),Mg2+ (终浓度 1 mM),冰上孵育10-15分钟。
样品太粘稠
有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白
蛋白可能是包涵体,没有在上清中
可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白,包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。
表达量太低
优化表达条件。
目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤被洗下来了
提高wash Buffer的pH,或者降低咪唑浓度。
目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来
降低Elution Buffer的pH值,或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。
使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子,同时得到目的蛋白。
蛋白降解
菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。在4°C下进行纯化操作。
洗脱组分不纯(含有多种蛋白)
洗杂不彻底
增加Wash Buffer体积。
样品中含有其他的组氨酸标签蛋白
通过调节pH值,或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段(如离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。
填料呈现褐色
缓冲液中含有DTT等还原剂
参考表2,适当降低还原剂DTT的浓度,或者改用巯基乙醇。
上样过程中蛋白发生沉淀
操作温度太低
室温下进行上样。
蛋白发生聚集
在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂,如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。