1. 产品介绍
Ni NTA Beads是以4%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸(NTA),螯合镍离子(Ni2+)后,可以形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构保护了镍离子免受小分子的进攻(产品结构见图1所示,三种产品结构示意图),更加稳定,具体性能见表1。Ni NTA Beads可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件(见表2),适用性更广,配体更稳定,选择性更高。
HisPur Ni NTA kit提供3ml Ni NTA Beads重力预装柱和组氨酸标签蛋白纯化所需的缓冲液,方便客户使用,操作简单,纯化效率高。试剂盒详细组分见表3。
表1. Ni NTA Beads产品性能
项目
性能
基质
4%琼脂糖凝胶
载量(/mL基质)
>40mg 6XHis-tagged protein
微球粒径(μm)
45–165
最大压力
0.1 MPa, 1 bar
储存缓冲液
含20% 乙醇的1XPBS
储存温度
4°C-30°C
表2. Ni NTA Beads试剂耐受情况
试剂种类
浓度
还原剂
5 mM DTE
1 mM DTT
20 mM β-mercaptoethanol
5 mM TCEP
10 mM reduced glutathione
变性剂
8 M urea
6 M Gua-HCl
去污剂
2% Triton™ X-100 (nonionic)
2% Tween™ 20 (nonionic)
2% NP-40 (nonionic)
2% cholate (anionic)
1% CHAPS (zwitterionic)
其他类
500 mM imidazole
20% ethanol
50% glycerol
100 mM Na2SO4
1.5 M NaCl
1 mM EDTA
60 mM citrate
缓冲液
50 mM sodium phosphate, pH 7.4
100 mM Tris-HCl, pH 7.4
100 mM Tris-acetate, pH 7.4
100 mM HEPES, pH 7.4
100 mM MOPS, pH 7.4
100 mM sodium acetate, pH 4
表3. HisPur Ni NTA Kit试剂盒组分
组分名称
货号
规格
数量
HisPur Ni NTA Column
SA004K-1
3mL
1
Lysis Buffer
SA004K-2
100mL
2
Elution Buffer
SA004K-3
2. 问题及解决方案
问题
原因分析
推荐解决方案
柱子流速慢
填料被堵塞
裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.2或 0.45 μm)过滤,或者离心去除。
样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直至粘度降低,或者添加DNase I (终浓度5 μg/ml),Mg2+ (终浓度 1 mM),冰上孵育10-15分钟。
样品太粘稠
有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白
蛋白可能是包涵体,没有在上清中
可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白,包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。
表达量太低
优化表达条件,使用包涵体纯化缓冲体系。
目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤被洗下来了
提高wash Buffer的pH,或者降低咪唑浓度。
目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来
降低Elution Buffer的pH值,或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。使用
10-100mM EDTA溶液剥离镍离子,同时得到目的蛋白。
蛋白降解
菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。
在4°C下进行纯化操作。
洗脱组分不纯(含有多种蛋白)
洗杂不彻底
增加Wash Buffer体积。
样品中含有其他的组氨酸标签蛋白
通过调节pH值,或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段(如离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。
填料呈现褐色
缓冲液中含有DTT等还原剂
参考表2,适当降低还原剂DTT的浓度,或者改用巯基乙醇。
上样过程中蛋白发生沉淀
操作温度太低
室温下进行上样。
蛋白发生聚集
在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂,如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。